** Состав выверен и доведен до соответствия необходимым параметрам

Приготовление:

Размешать 50,0 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды. Прокипятить для полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавированием при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин.

Принцип и оценка результата:

На этой среде обильный рост дают многие бактерии. Ее рекомендуют для получения больших количеств микробной массы в ходе получения вакцины или токсина.

Эта среда по своему составу подобна Среде с мясным экстрактом (АТСС Medium 225). Пептический перевар животной ткани и настой говядины обеспечивают присутствие в среде азота, серы, витаминов и других веществ, необходимых для получения обильного роста микроорганизмов. Натрия хлорид обеспечивает изотоничность среды.

Контроль качества:

Внешний вид порошка:

Гомогенный сыпучий желтый порошок.

Плотность готовой среды:

Образуется среда, соответствующая по плотности 2,5%-ному агаровому гелю.

Цвет и прозрачность готовой среды:

Среда имеет желтую окраску, прозрачна или слегка опалесцирует, если в чашках Петри формируется гель.

Кислотность среды:

При 25°С водный раствор (5,0% вес/об) имеет рН 7,5 ± 0,2.

Культуральные свойства:

Ростовые характеристики референс-штаммов через 18-48 ч при 35°С.

К 1000 мл мясопептонного бульона перед стерилизацией добавляют 20 г агара и кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения.

Мясопептонный агар, охлажденный до температуры 50- - 55° С, осветляют яичным белком (из расчета один белок на 1000 мл мясопептонного агара), по­мешают в автоклав, не завинчивая крышку автоклава, или в аппарат Коха на 1 ч чтобы белок свернулся и, оседая, увлек за собой взвешенные частицы. Горя­чий Мясопептонный агар фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавли­вают в нем рН 7,0-7,4, разливают во флаконы или пробирки и 20 мин стерили­зуют в автоклаве при температуре 120° С.

Мясопептонный желатин

К мясопептонному бульону прибавляют мелко нарезанный желатин из расче­та ю-15 г на 100 мл. После набухания желатин растворяют при медленном нагревании в водяной бане при температуре 40-45 °С, устанавливают рН=7,0 10%-ным раствором бикарбоната натрия, фильтруют через бумажный фильтр в горячем виде. Среду разливают в пробирки по 5-8 мл, стерилизуют дробно 3 дня по часу при температуре 100° С или однократно при 110° С в течение 20 мин. После стерилизации среду охлаждают.

Пептонная вода

К 1000 мл дистиллированной воды добавляют 10 г пептона и 5 г хлористого натрия, кипятят до растворения пептона, фильтруют и устанавливают рН 7,2- 7,4, после чего стерилизуют 30 мин при температуре 120° С.

Элективные среды для выявления возбудителей пищевых то кс и ко инфекций Среды фуксин - сульфитный агар (среда Эндо), бакто-агар Плоскирева, ме-тилен-эозиновая среда Левина, висмут-сульфит агар (среда Вильсон-Блера) го­товят из сухих стандартных сред по прописи, указанной на этикетке.

Среда Смирнова

К 1 л расплавленного МП А добавить 10-12 г лактозы и 4-5 мл 1,2% рас­твора бромкрезолпурпур. Стерилизовать дробно (или при 0,5 атм 20 мин).

Среды накопления сальмонелл Среда Мюллера Для приготовления среды Мюллера готовят вначале растворы серноватисто-кислого натрия и Люголя.

В мерный цилиндр с 50 г серноватистокислого натрия добавляют до 100 мл Дистиллированной воды. Раствор переливают в бутыль и стерилизуют текучим паром в течение 30 мин.

Для приготовления среды Мюллера в стерильные флаконы помещают по 4,5 г мела и стерилизуют их сухим паром в течение 1 ч. Затем наливают в каждый флакон по 90 мл бульона из перевара Хоттингера, содержащего 130- 150 мг % азота, устанавливают рН 7,2-7,4 и стерилизуют 30 мин при температуре

120°С После стерилизации вновь устанавливают рН 7,2-7,4, для чего прове­ряют в одном из флаконов и определяют необходимый для подтитровки дан­ного количества среды объем соляной кислоты или гидрата окиси натрия. Затем в асептических условиях перед употреблением добавляют по 2 мл раствора Лю-голя и по 10 мл раствора серноватистокислого натрия.

Таблица 1 Рост возбудителей пищевых токсикоинфекций на элективных средах и МПА

К 100 мл мясного бульона добавляют 1 % пептона Пептон- это продукт ферментативного гидролиза белков. Добавляют пептон в среду для увеличения ее питательности, для уплотнения среды в нее добавляют от 2 до 4 % агар-агара

Питательная среда д.б. слабокислой по отношению к цитоплазме микроорганизмов, которые будут выращиваться в ней. Для этого в среду добавляют 0,5% поваренной соли. Реакция среды от 7,0 до 7,4. После введения агар-агара смесь прогревают до неполного студнеобразования.

Приготовление мясо-пептонного желатина.

Эта среда готовится аналогично МПА, но для уплотнения ее применяют на агар-агар, желатин в количестве 10-12% . МПЖ имеет ряд преимуществ перед МПА. Он Лучше соединяется со стеклом, гнилостные бактерии образуют при росте на этой среде весьма характерные колонии, кроме того, некоторые из гнилостных бактерий обладают способностью разжижать желатин, что очень важно для определения вида бактерий. Но МПЖ" плавится при температуре 30-37 0 С, в этом его недостаток.

Дня изучения биохимических признаков микроорганизмов пользуются дифференциально-фагностическими средами. Примером таких сред могут служить среды Гисса. Их применяют для изучения способности м.о. ферментировать углеводы.

В состав сред Гисса входит 1% какого-либо углевода, 1% агар-агара и индикатор. Примером такой среды является и среда Эндо, применяемая для выделения Bact. coli. В состав этой среды входит, кроме МПА, насыщенный спиртовой раствор фуксина, 1% лактозы Na 2 SO 3 , рН 7-7,2 Bact. coli дает на среде Эндо колонии с металлическим блеском. Для изучения плесневых грибов используют среду Сабуро, следующего состава: 1% глюкозы, 1% пептона, 2% агар-агара рН 5-5.6.

ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ:

Приготовить 100 мл МПА:

1. В кастрюлю напивают воду и ставят на горелку - готовят водяную баню.

2. В колбу наливают 100 мл МБ. Взвешивают 2 г. пептона. 0,5 г. агар-агара. Все это помещают в колбу с мясным бульоном.

3. Колбу ставят в кастрюлю с горячей водой и содержимое колбы подогревают до тех пор пока полностью не расплавится агар-агар и среда не станет однородной. Затем добавляют соды (до слабощелочной реакции по лакмусу).

4. Расплавленную среду разливают в пробирки по 10 мл.

5. Готовят ватные пробирки, обтягивают их марлей и закрывают пробки с приготовленной питательной средой.

6. Пробирки с МПА помещают в корзины. Сдают лаборанту для стерилизации.

Классификация питательных сред

По составу питательную среду подразделяют на 2 группы: натуральные среды неопределенного состава и синтетические среды.

Натуральными обычно называют среды, которые состоят из продуктов животного или растительного происхождения, имеющих сложный неопределенный хим. состав. Основой таких сред являются различные части зеленых растений, животные ткани. солод, дрожжи, фрукты, овощи... Большинство из них используется в виде экстрактов или настоев. Однако среды с неопределенным составом малопригодны для изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов, поскольку они не позволяют учесть потребление ряда компонентов среды, а с другой стороны выявить, какие вещества образуются по ходу развития м.о. Это связано с тем, что состав натуральных питательных сред очень сложен, кроме того он не является постоянным. Натуральные среды неопределенного состава используются главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагностических целей. К числу сред неопределенного состава относят и так называемые среды «полусинтетические». В их состав наряду с известными хим. соединениями входят вещества неопределенного состава Такие среды находят широкое применение в пром. микробиологии для получения аминокислот, витаминов и антибиотиков. В качестве примера таких сред можно назвать: мясопептонная среда, в состав которой одновременно с мясным экстрактом и пептоном входит поваренная соль, фосфорнокислый каши, иногда глюкоза или сахароза, картофельные среды с глюкозой или пептоном.

Синтетические среды - это такие среды в состав которых входят только определенные, химически чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях. Синтетические среды могут иметь относительно большой набор компонентов, но могут быть довольно простыми по составу. Синтетические среды наиболее удобны для исследования обмена веществ микроорганизмов. Зная точный состав и количество входящих в среду компонентов, можно изучить их потребление и превращение в соответствующие продукты обмена

По назначению: различают элективные и дифференциально-диагностические среды

Элективные среды обеспечивают развитие преимущественно одного вида м.о. или группы родственных микроорганизмов (менее пригодны или совсем не пригодны для развития других). Такие среды применяют главным образом для выделения.

Микроорганизмов из мест их естественного обитания, для получения накопительных культур.

Дифференциально-диагностические среды : это такие среды, которые позволяют по возможности очень быстро отличить (дифференцировать) одни виды м.о. от других. Их состав подбирается с таким расчётом, чтобы он позволил чётко выявить наиболее характерные свойства данного вида м.о. Нередко это достигается введением в среды специальных красителей-индикаторов.

По физическому состоянию среды разделяют на жидкие, плотные и сыпучие. Для выяснения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, а также для накопления их биомассы или продуктов обмена наиболее удобно применять жидкие среды. Плотные среды используют для выделения чистых культур. В промышленной биологии применяют так называемые сыпучие среды. К ним относятся разваренное пшено, пропитанное питательным раствором.

Вопросы для самоконтроля:

2. Как классифицируют их по агрегатному состоянию?

3. Как делятся питательные среды по назначению? В каких случаях удобнее применять те или иные среды?

4. Какие среды называют дифференциально-диагностическими?

5. Как готовят питательные среды? Какие студнеобразователи чаще всего применяют?

6. Что входит в состав МПА? Как его готовят?

7. Чем отличается МПА от МПЖ?

Домашнее задание:

1. Оформление отчета по лабораторному занятию.

2. Подготовиться к защите лабораторного занятия.

Лабораторная работа № 5

Мясопептонного агар (МПА) — самое распространенное универсальное питательную среду в микробиологических исследованиях.

Состав

• ферментативный пептон
• экстракт мяса (1: 2)
• натрия хлорид
• глюкоза

Описание

Препарат представляет собой плотное питательную среду желтого цвета.

Выпускается в виде плотной питательной среды по 300 мл в стеклянных флаконах, откупоренных пробками завальцованы алюминиевыми колпаками.

Назначение

Используется для культивирования и изучения культуральных свойств различных микроорганизмов.

Возможно использование препарата как питательной основы для приготовления различных питательных сред целевого назначения.

Хранение

Срок годности — 2 года. Сохраняется среда герметично закрытым при температуре от 2 до 25 ° C в местах, защищенных от воздействия прямых солнечных лучей.

Приготовление

До 1 л мясо-пептонам бульона добавляют 15-20 г мелко нарезанного агар-агара. Среда нагревают до растворения агара (температура плавления его 100 ° С, застывания -40 ° С), устанавливают слабощелочную реакцию среды 20% -ным раствором Na2CO3, a и через воронки разливают в пробирки (но 10 мл для розливок в чашки — агар столбиком и по 5 мл для получения скошенного, наклонного агара). При разливке агара необходимо следить затем, чтобы края пробирки были сухими, иначе пробки прилипают к стеклу. Пробирки со средой стерилизуют в автоклаве при 120 ° С в течение 20 мин.

Существует и другой вариант среды — мясо-пептона желатина (МПЖ), где вместо агара для затвердевания среды используют желатин. В 1 л бульона мясопептонного добавляют 100-150 г желатина. Температура плавления зависит от процентного содержания в среде. 10% желатина плавится при 24 ° С, 15% — при 25 °. В летнее время среды готовят, добавляя 15% желатины. После растворения желатина при осторожном нагревании в среде устанавливают слабощелочную реакцию (как и для МПБ и МПА), кипятят в течение 5 мин, затем охлаждают-до 40-50 ° С Одновременно яичный белок взбивают с небольшим количеством воды, вливают его в охлажденную желатиновую среду, хорошо взбалтывают и снова нагревают. Среда после выпадения белков становится прозрачным. Его фильтруют через горячую воронку, разливают в пробирки и стерилизуют в кипятильнике Коха текучим паром, прогревая среду по 30 мин через 24 ч три раза.

Мясо-пептонный бульон (МПБ). Для приготовления мясо-пептонных сред используют мясной бульон, который получают следующим образом: 500 г мелко изрубленного свежего мяса без костей, жира и сухожилий заливают в эмалированной кастрюле 1 л водопроводной воды, нагретой до 50°С, и оставляют настаиваться 12 ч при комнатной температуре или 1 ч при 50-55°С. Мясо отжимают, экстракт процеживают через марлю со слоем ваты, кипятят 30 мин для свертывания коллоидных белков и фильтруют дважды (первый раз через марлю с ватой, второй - через бумажный фильтр). Фильтрат доливают водой до 1 л, разливают в колбы, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120°С 20 мин (пробки колб закрывают сверху колпачками из бумаги). Ватные пробки должны быть плотными, так как они служат фильтром, препятствующим проникновению бактерий из воздуха после стерилизации.

Мясной бульон может быть использован в любое время для приготовления соответствующих сред. Если их готовят сразу, то предварительная стерилизация мясного бульона не требуется.

Нередко в лабораторных условиях мясной настой кипятят вместе с мясом, затем мясо отжимают. При этом бульон получается хорошего качества. При потребности в мясном бульоне особо высокой питательности во время настаивания мяса с водой добавляют немного пепсина и подкисляют бульон соляной кислотой. Пепсин способствует дополнительной гидролизации белковых соединений мяса, и в результате количество доступных бактериям питательных веществ возрастает. Мясо можно заменить мясным экстрактом (5 г на 1 л среды).

Для приготовления МПБ к 1 л мясного бульона добавляют 5-10 г пептона (первый продукт гидролиза белка) для повышения калорийности среды и 5 г поваренной соли для создания осмотической активности. Среду нагревают до растворения пептона, постоянно помешивая.

Затем устанавливают нейтральную или слабощелочную реакцию среды, приливая 20%-ный раствор Na 2 CO 3 до посинения влажной красной лакмусовой бумажки. Дли проверки рН среды удобно использовать индикатор бромтимолблау: 1-2 капли его смешивают в фарфоровой чашке с каплей бульона. В нейтральной среде бромтимолблау - бутылочно-зеленый, в кислой - желтый, в щелочной - синий.

После установления рН среду снова кипятят 5-10 мин, и белки, свернувшиеся при изменении реакции среды, отфильтровывают через бумажный фильтр без осветления бульона или осветлив его белком. Для этого свежий яичный белок взбивают с двойным по объему количеством воды и смешивают с охлажденным до 50 °С бульоном. Смесь кипятят, помешивая, на слабом огне 10 мин, затем фильтруют. Прозрачный мясо-пептонный бульон разливают в пробирки, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120 °С 20 мин.

Мясо-пептонный агар (МПА). К 1 л МПБ добавляют 15- 20 г агара. Среду нагревают до растворения агара (температура его плавления - 100 °С, затвердевания - 40 °С), устанавливают слабощелочную реакцию среды 20%-ным раствором Na 2 CO 3 и через воронку разливают в пробирки (приблизительно по 10 мл агара столбиком для последующего разлива по чашкам Петри и по 5 мл для получения скошенного агара - косяков).

При разливе агара необходимо следить за тем, чтобы края пробирок оставались сухими, иначе пробки прилипнут к стеклу. Пробирки со средой стерилизуют в автоклаве при 120 °С 20 мин.

Мясо-пептонная желатина (МПЖ). В 1 л МПБ помешают 100-150 г желатины. Температура плавления желатины зависит от ее содержания в среде: в случае 10%-ной концентрации в среде она плавится при 24 °С; в случае 15%-ной - при 25 °С. В летнее время среды готовят, добавляя 15% желатины.

После растворения желатины при осторожном нагревании устанавливают слабощелочную реакцию среды (как для МПБ и МПА), кипятят 5 мин, затем охлаждают до 40-50 °С. Взбитый, с небольшим количеством воды яичный белок вливают в охлажденную желатиновую среду, хорошо взбалтывают и снова нагревают. Среда после выпадения белков в осадок становится прозрачной. Ее фильтруют в горячем виде через бумажный фильтр, разливают в пробирки и стерилизуют в кипятильнике Коха текучим паром, прогревая среду 3 раза по 30 мин каждые 24 ч.

Картофельный агар. Нарезают ломтиками 200 г очищенного и промытого водой картофеля, заливают 1 л водопроводной воды, варят 30 мин. Отвар фильтруют через вату и добавляют воду до первоначального объема. К полученной жидкости прибавляют 2% агара, кипятят до его расплавления и устанавливают нейтральную реакцию среды (рН = 7). Среду стерилизуют 20 мин при 1 атм 1 .

Пивное сусло и сусло-агар. Зерна ячменя замачивают в холодной воде и проращивают при 35 °С. После того как ростки станут вдвое длиннее зерен, последние высушивают до воздушно-сухого состояния (можно при слабом подогревании), получая солод. Для приготовления сусла солод крупно размалывают и смешивают с водой (250 г солода на 1 л воды). Для лучшего выделения фермента амилазы смесь подогревают при 57 °С до исчезновения реакции на крахмал (синего окрашивания с иодом). Пробы на осахаривание крахмала проводят в фарфоровой чашке в капле жидкости.

Сусло процеживают через вату, затем фильтруют через бумажный фильтр. Такое сусло содержит 10-20% сахара. Точное его содержание определяют по плотности раствора при помощи сахариметра. Сусло разбавляют водой до концентрации сахара 6-8% и стерилизуют 30 мин при 115 °С и давлении 0,5 атм. Готовое сусло можно получить на пивоваренном заводе.

Для приготовления сусло-агара к пивному суслу добавляют 2,5-3% агара, кипятят до расплавления, фильтруют через вату и стерилизуют при тех же условиях, как и пивное сусло.

Обезжиренное молоко. Для приготовления питательных сред используют снятое молоко, так называемый обрат, так как жир в молоке неблагоприятно влияет на рост некоторых микроорганизмов. Обрат получают сепарированием молока, нагретого до 34 °С. Можно удалять жир и при отстаивании молока.

При стерилизации следует помнить о том, что молоко нельзя длительное время выдерживать в автоклаве, так как лактоза (молочный сахар), содержащаяся в молоке, может карамелизоваться.

Обезжиренное молоко разливают в стерильные пробирки и выдерживают при 115 °С (давление 0,5 атм) 10 мин. Перед стерилизацией кислотность обрата не должна превышать 22° Тернера, иначе молоко свернется. После стерилизации его выдерживают 3 сут в термостате при 30°С. чтобы спровоцировать развитие спорообразующих и других стойких к нагреванию форм. Через 3 сут пробирки с молоком просматривают и те, в которых развились микроорганизмы, выбраковывают.

При стерилизации в автоклаве иногда возможно побурение молока вследствие карамелизации молочного сахара и пептонизании казеина. При длительной стерилизации на дно пробирки выпадает осадок казеина, который может частично пептонизироваться. Перегретoe побуревшее молоко в качестве среды использовать нельзя.

Дрожжевые среды. Дрожжевая вода. 50-100 г сухих дрожжей разводят в 1 л воды, кипятят 10 мин, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют текучим паром по 30 мин в течение 3 дней ежедневно.

Дрожжевой автолизат. 200 г прессованных дрожжей разводят в 1 л воды; добавляют 2 г Na 2 HPO 4 , каплями I н. раствор NaOH (до рH 6,1) и 5 мл хлороформа, выдерживают при 37 °С 2 сут, доводят раствором NaOH до рН 7,4, кипятят 30 мин. фильтруют через бумажный фильтр, разливают в посуду и стерилизуют при 115 °С 30 мин.

Дрожжевой экстракт. 1 кг прессованных дрожжей разводят в 1 л воды, смесь кипятят 1 ч, трижды отфильтровывают через бумажный фильтр и стерилизуют при 115 °С 30 мин.

Бобовый отвар. 50 г фасоли (лучше белой) заливают 1 л водопроводной воды и варят до готовности так, чтобы бобы не разварились. Полученный отвар фильтруют через вату, добавляют к нему 10 г сахара и доводят до первоначального объема. Устанавливают слабощелочную реакцию среды, разливают в колбы и стерилизуют в автоклаве 30 мин при давлении пара 1,5 атм.

1 По системе СИ давление принято выражать в паскалях (Па): 1 атм = 1,01325 х 10 5 Па = 0,1 МПа.